解剖学报

作者：何琦,赵威,张志谦

单位：1.重庆医科大学检验医学院，教育部临床实验室诊断学重点实验室，重庆 400016; 2.北京大学临床肿瘤学院暨北京市肿瘤防治研究所细胞生物学研究室， 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室， 北京 100142

关键词：α2δ1, 规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9, 肝癌干细胞, 基因敲减, 自我更新, 免疫印迹法, 人 

目的 通过规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统敲减人肝癌细胞系Hep12中电压依赖性钙离子通道 α2δ1的表达，观察α2δ1敲减后对肝癌细胞干性的影响。：：方法 设计3对靶向α2δ1的向导 (sgRNA)，长度为20 bp，构建到lenti CRISPRv2-puro载体上，然后在体外检测sgRNA切割活性，利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒，将包装好的病毒感染Hep-12细胞，2 d后加入嘌呤霉素筛选。利用Western blotting验证α2δ1的敲减效果和干性相关基因的表达。通过成球实验检测其体外自我更新能力的变化。：：结果： 测序结果显示，sgRNA成功插入载体质粒；体外切割实验显示，3条sgRNA均有切割活性；Western blotting结果显示，α2δ1基因的表达显著降低，干性相关基因B细胞特异性莫洛尼白血病病毒插入位点1(BMI1)和Nanog的表达显著被抑制；无血清培养基成球实验结果表明，敲减α2δ1导致Hep-12细胞的体外自我更新能力减弱。：：结论： 利用CRISPR/Cas9技术成功构建敲除α2δ1基因的Hep-12细胞系；敲除α2δ1基因后能抑制Hep-12细胞肿瘤干细胞样特性。

来源：2020年第6期

《解剖学报》期刊编辑部

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